Medical practices evolved over millennia, from ancient civilizations like Egypt and Mesopotamia to the groundbreaking
摘要:慢病毒載體(LV)在基因治療領域展現出巨大潛力,但其大規模生產,尤其是下游純化環節,一直是走向臨床和商業化的主要瓶頸。本期分享的這篇來自*Molecular Therapy Methods & Clinical Development*的研究,由芬蘭庫奧皮奧基因與細胞治療中心的Anniina J. Valkama等人完成,系統性地開發并優化了一套可規模化的LV下游生產工藝,成功處理了180L的初始收獲液,最終獲得了高滴度、高純度的臨床級候選產品。本文將為您解讀該研究的核心內容與重要發現。
一、研究背景:為什么下游工藝如此重要?
慢病毒載體能夠感染分裂和非分裂細胞,已成為基因治療的熱門工具,用于治療癌癥和血液疾病,更多療法正處于臨床試驗階段。
然而,將實驗室規模的LV生產成功轉化為滿足臨床需求的大規模生產充滿挑戰。LV顆粒脆弱,容易在處理過程中失去活性。上游生產(病毒培養)的規模擴大已取得進展,但下游處理(DSP:澄清、濃縮、純化、制劑)則成為新的“卡脖子”環節。如何高效地從大量培養液中捕獲、純化并濃縮LV,同時保持其高感染活性并去除雜質(如宿主細胞DNA、蛋白質),是本研究致力解決的核心問題。
二、下游工藝全流程概覽
1.澄清(Clarification):去除細胞碎片和大顆粒雜質。
2.濃縮與緩沖液交換(TFF1):使用切向流過濾(TFF)技術濃縮病毒液,并將其置換到適合層析純化的緩沖液中。
3. 捕獲純化(Chromatography):使用陰離子交換(AEX)層析作為核心純化步驟,有效去除宿主DNA和蛋白質等雜質。
4. 最終制劑(TFF2):再次使用TFF將純化后的病毒置換到最終制劑緩沖液中,以確保長期儲存的穩定性。
流程核心:盡可能減少步驟、縮短處理時間,以最大限度保持LV活性。
三、關鍵步驟的深度優化與發現
1.澄清:平衡雜質去除與病毒回收率
●挑戰:需要高效去除雜質,同時避免病毒被吸附或機械損傷。
●發現:比較了不同孔徑和材料的深度過濾器。較大孔徑的過濾器雖然DNA清除率略低,但病毒功能活性回收率(75%-90%)顯著更高,因此被選為最佳方案。
●重要技巧:過濾后使用緩沖液沖洗過濾器,可額外增加高達60%的病毒回收量,這一操作在放大生產中被證明至關重要。
2.切向流過濾(TFF1):選擇與優化
●挑戰:濃縮過程會產生剪切力、壓力變化和泡沫,可能導致病毒包膜破裂失活。
●膜材與截留分子量(MWCO)選擇:
⑴材料:纖維素膜親水性更好,跨膜壓力(TMP)增長更慢,更不易堵塞,更適合大規模生產。
⑵MWCO:300kd膜DNA清除率更高,但100kd膜的功能病毒回收率更優。
⑶參數優化:本研究TMP控制在0.2-0.5bar,確定了關鍵操作參數(如通量、跨膜流速百分比),以確保高回收率(約75%)。研究還發現,在過程結束時關閉滲透流進行循環沖洗,可顯著提高最終產物的回收量。
3.層析純化:突破瓶頸的關鍵
層析步驟是下游工藝中回收率損失最大的環節,也是優化的重點。
●介質篩選:結果表明,Q膜析介質從濃縮液(TFF1產物)中回收功能性病毒的效果最好且最穩定。
●洗脫策略:線性梯度洗脫通常出現兩個峰,第一個峰(在電導率開始上升時立即洗脫)含有最完整的病毒,雜質(DNA)較少;第二個峰含有大量DNA和少量病毒。優化后采用階梯梯度洗脫(12%, 30%, 45%緩沖液B),成功將主要病毒產品富集在12%洗脫峰中,提高了目標產物的純度。
●挑戰與取舍:高鹽濃度洗脫可以提高病毒回收率,但也會帶入更多雜質。因此,必須在回收率和純度之間找到平衡。該研究通過優化,實現了98%以上的宿主DNA清除率。
4.最終制劑:為病毒“保鮮”
LV的穩定性至關重要。研究團隊篩選了多種最終制劑緩沖液(FFB),以評估它們在-80℃、4℃和室溫下的保護效果。
核心發現:
●-80℃儲存:含10%蔗糖的50mM HEPES緩沖液和含20mM MgCl?的PBS緩沖液在保持病毒活性方面表現最佳,顯著優于普通PBS。
●4℃和室溫:所有緩沖液都無法完全阻止活性下降,但含5%蔗糖和20 mM MgCl?的HEPES緩沖液相對最好。
●最終選擇:結合上述發現,選擇50mM HEPES + 20mM MgCl?+ 10% sucrose (pH 7.5)作為最終制劑緩沖液,以兼顧長期冷凍儲存和短期操作穩定性。
四、規模化生產成果
研究團隊成功進行了兩次大規模生產運行(一次使用LV-GFP,一次使用LV-TK),驗證了工藝的可放大性。
第二次規模化運行(LV-TK)結果:
起始體積:178.4 kg(約180升)收獲液。
最終產品:570 mL。
最終滴度:功能滴度高達1.97×109TU/mL。
總產量:1.12×1012個轉導單位(TU)。
純度:宿主DNA清除率達到99.8%。
產品質量:病毒顆粒與功能顆粒的比值(vp/TU)約為3.5×103,與同類大型生產報告的質量相當。
安全性:最終產品經檢測,不含復制型慢病毒。
文獻信息:Valkama, A. J., et al. (2020). Development of Large-Scale Downstream Processing for Lentiviral Vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev., 17, 717-730.DOI: 10.1016/j.omtm.2020.03.025